DNA序列測(cè)定分手工測(cè)序和自動(dòng)測(cè)序,手工測(cè)序包括sanger雙脫氧鏈終止法和maxam-gilbert化學(xué)降解法。自動(dòng)化測(cè)序?qū)嶋H上已成為當(dāng)今 dna序列分析的主流。美國(guó)pe abi公司已生產(chǎn)出373型、377型、310型、3700和3100型等dna測(cè)序儀,其中310型是臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室中使用*多的一種型號(hào)。 1.a(chǎn)bi prism 310基因分析儀是**精密儀器,需專人操作、管理和維護(hù)。
2.本實(shí)驗(yàn)測(cè)序pcr反應(yīng)的總體積是5μl,而且未加礦物油覆蓋,所以pcr管蓋的密封性很重要,除加完試劑后蓋緊pcr管蓋外,*好選用pe公司的pcr管。如pcr結(jié)束后pcr液小于4~4.5μl,則此pcr反應(yīng)可能失敗,不必進(jìn)行純化和上樣。
3.作為測(cè)序用戶來(lái)說(shuō),只需提供純化好的dna樣品和引物,一個(gè)測(cè)序pcr反應(yīng)使用的模板不同,需要的dna量也就不同,pcr測(cè)序所需模板的量較少,一般pcr產(chǎn)物需30~90ng,單鏈dna需50~100ng,雙鏈dna需200~500ng,dna的純度一般是a260nm/a280nm為 1.6~2.0,*好用去離子水或三蒸水溶解dna,不用te緩沖液溶解。引物用去離子水或三蒸水配成3.2pmol/μl較好。
4.本實(shí)驗(yàn)使用的測(cè)序試劑盒是bigdye熒光標(biāo)記終止底物循環(huán)測(cè)序試劑盒,一般可測(cè)dna長(zhǎng)度為650bp左右。本儀器dna測(cè)序**度為 (98.5±0.5) %,儀器不能辨讀的堿基n<2%,所需測(cè)定的長(zhǎng)度超過(guò)了650bp,則需設(shè)計(jì)另外的引物。為保證測(cè)序更為準(zhǔn)確,可設(shè)計(jì)反向引物對(duì)同一模板進(jìn)行測(cè)序,相互印證。對(duì)于n堿基可進(jìn)行人工核對(duì),有時(shí)可以辨讀出來(lái)。為提高測(cè)序的**度,根據(jù)星號(hào)提示位置,可人工分析該處彩**譜,對(duì)該處堿基作進(jìn)一步核對(duì)。
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